Тест «CEDIA® Вальпроевая кислота II»

№ по каталогу: 100013 (наборы 13 х 11 мл                                 Для диагностики in vitro

Предназначение

Тест «CEDIA® Вальпроевая кислота II» - это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения вальпроевой кислоты в сыворотке и плазме человека.

Резюме и разъяснение теста

Вальпроевая кислота (ВПК; 2-пропилпентановая кислота; Depakene®) – это противосудорожное лекарство, которое используется, главным образом, при лечении первичных и вторичных генерализированных припадков, однако оно также эффективно при малых эпилептических припадках.^1-5

В терапевтических концентрациях свыше 90% циркулирующей ВПК связывается с белками плазмы, главным образом, с альбумином.⁶

У ВПК наименьшее число побочных эффектов из всех широко используемых противоэпилептических средств.^7,8 Наиболее распространенными побочными эффектами являются желудочно-кишечные расстройства, как например, тошнота и рвота.

Фармакокинетика ВПК отличается высокой изменчивостью в зависимости от формы лекарства и пути введения, а также индивидуальных различий в объеме распределения, метаболизме и клиренсе.^9,10 Мониторинг концентраций ВПК во время терапии необходим врачу в качестве индикатора для корректировки дозы.

В тесте «CEDIA® Вальпроевая кислота II» применена технология рекомбинантной ДНК (Патент США №4708929), которая позволила получить уникальную систему гомогенного иммуноферментного анализа.¹¹

В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента, т.е. акцепторную часть фермента (EA) и донорскую часть фермента (ED). Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.

В ходе анализа анализируемое вещество в образце конкурирует с анализируемым веществом, сопряженным с одним неактивным фрагментом b-галактозидазы за место связывания антитела. Если в образце присутствует анализируемое вещество, оно связывается с антителом, при этом неактивные фрагменты фермента свободно образуют активный фермент. Если анализируемого вещества в образце нет, антитело связывается с анализируемым веществом, сопряженным с неактивным ферментом, подавляя повторное соединение неактивных фрагментов b-галактозидазы, при этом не происходит образования активного фермента. Количество образованного активного фермента и вызванное этим изменение абсорбции прямо пропорциональны содержанию лекарства в образце.

Реагенты

1          EA буферный растворитель: содержит N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N’-[2-этансульфоновую кислоту], стабилизатор и консервант (13 мл)

1а        EA реагент: содержит акцепторную часть фермента (0,25 г/л), моноклональные анти-ВПК антитела (24 мг/л), АБС, салицилат натрия, буферные соли и консервант

2          ED буферный растворитель: содержит N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N’-[2-этансульфоновую кислоту], стабилизаторы и консервант (11 мл)

2а        ED реагент: содержит донорную часть фермента (40 мкг/л), сцепленную с ВПК, хлорфенол красный-b-D-галакторинанозид (2,4 г/л), антитела козы к антителам мыши (27 мг/л), буферные соли, стабилизатор и консервант

Требуемые дополнительные материалы (продаются отдельно):

Калибровочный набор CEDIA Core TDM Multi-Cal, № по каталогу 100007

Имеющиеся в продаже контрольные образцы – Относительно рекомендаций проконсультируйтесь в Службе технической поддержки клиентов

Меры предосторожности и предупреждения

Реагенты содержат азид натрия. Избегайте попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Подвергшиеся воздействию участки следует промыть большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании необходимо немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступить в реакцию с цинковой или медной сантехникой, образуя потенциально взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывайте их большими количествами воды, чтобы предотвратить накопление азидов. Очищайте открытые металлические поверхности 10% гидроксидом натрия.

Приготовление и хранение реагентов

Вынимайте набор из холодильника непосредственно перед приготовлением растворов.

Чтобы максимально снизить риск возможного загрязнения, готовьте растворы в следующем порядке.

Раствор донорской части фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент ED) и емкость 2 (буферный растворитель ED) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из емкости 2а оказался в емкости 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить емкость 2а и переходник от емкости 2 и выбросить их. Закрыть емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при комнатной температуре (15-25°С). Снова перемешать содержимое и написать на этикетке емкости дату разведения. Прежде чем использовать, нужно поставить емкость непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник (2-8°С) и дать постоять в течение 5 минут.

Раствор акцепторной части фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент EA) и емкость 1 (буферный растворитель EA) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из емкости 1а оказался в емкости 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить емкость 1а от переходника и выбросить. Закрыть наполненную емкость 1 крышкой и оставить примерно на 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать на этикетке емкости дату разведения. Прежде чем использовать, нужно поставить емкость непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник (2-8°С) и дать постоять в течение 5 минут.

ПРИМЕЧАНИЕ1: Входящие в этот набор компоненты предназначены для использования в комплекте. Не смешивайте компоненты из разных партий.

ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрестного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от бутылей с реагентами совпадали с бутылями. Раствор R2 (донорская часть фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет говорит о загрязнении реагента, и его следует вылить.

ПРИМЕЧАНИЕ 3: До проведения анализа растворы R1 и R2 до анализа должны находиться при температуре отсека анализатора для реагентов. См. дополнительную информацию в инструкции по применению конкретного анализатора.

ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности восстановленного раствора EA, его следует защищать от продолжительного непрерывного воздействия яркого света.

Храните компоненты при требуемой температуре следующим образом. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ ИХ. Относительно стабильности неоткрытых компонентов см. срок годности на коробке или ярлыках бутылей.

Раствор R1: 45 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.

Раствор R2: 45 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С

Сбор и обработка образцов

Для анализа годятся образцы сыворотки или плазмы (Na или Li гепарин; Na ЭДТА). Избегайте пенообразования и повторного замораживания образца. Образцы, содержащие частицы, следует подвергнуть обработке в центрифуге. Закрывайте образцы крышками, храните при температуре 2-8°С и проводите анализ в течение 1 недели после сбора. Если анализ нельзя провести в течение 1 недели, или если образец необходимо отправить в другое место, следует закрыть образец крышкой и держать в замороженном виде. Хранить образцы при температуре -20°С и проводить анализ в течение 4 недель. Со всеми образцами пациентов следует обращаться так, как если бы они были потенциально заразными.

Процедура анализа

Для выполнения этого анализа можно использовать биохимические анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. В компании Microgenics имеются инструкции по применению, содержащие конкретные параметры приборов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.

Контроль качества и калибровка¹²

Рекомендуется калибровка по 2 точкам

- после замены бутыли с реагентом

- после замены партии реагента

- согласно требованиям процедур контроля качества

Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем для двух концентраций (низкие и высокие значения) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты стандарта не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры.

Результаты и ожидаемые значения

Тест CEDIA® на вальпроевую кислоту предназначен для количественной оценки образцов пациентов в диапазоне значений от 3 мкг/мл до значения калибратора высокой концентрации Core TDM Multi-Cal (примерно 150 мкг/мл). Результаты по образцам, концентрация в которых ниже 3 мкг/мл, должны выглядеть как <3мкг/мл. Результаты по образцам, концентрация в которых превышает 150 мкг/мл, могут выглядеть как >150мкг/мл, или же можно развести одну часть образца одной частью калибратора низкой концентрации Core TDM Multi-Cal и повторить анализ. Полученное после повторного анализа значение необходимо вывести следующим образом:

Фактическое значение = (2 х значение разведенного образцы) – концентрация калибратора низкой концентрации Core TDM Multi-Cal

Для перевода мкг/мл в мкмоль/л используйте следующий переводной коэффициент:

                                               мкг/мл х 6,93 = мкмоль/л

                                               мкмоль/л х 0,144 = мкг/мл

Терапевтическая эффективность и токсическое воздействие тесно связаны с концентрацией лекарства в сыворотке. По сообщениям, эффективная концентрация ВПК в сыворотке для остановки припадка составляет 50 – 100 мкг/мл.^13-15 Однако ряд факторов может осложнить интерпретацию уровней ВПК в сыворотке³, включая промежуток времени между введениями лекарства, тип припадков, концентрацию альбумина и присутствие других противоэпилептических лекарств. Следовательно, корректировка дозы должна основываться и на клинических, и на лабораторных данных.

Ограничения

1. Число пациентов, у которых могут быть антитела к b-галактозидазе      E. coli, чрезвычайно      мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать      ошибочно высокие концентрации прокаинамида, не соответствующие      клиническому профилю.
2. Так как в тесте используются антитела мыши,      существует вероятность интерференции противомышиных антител человека (HAMA) в образце, что      может привести к ложно повышенным результатам.

Конкретные рабочие характеристики

Ниже показаны типичные данные, получаемые на анализаторе Hitachi 911. Результаты, получаемые в Вашей лаборатории, могут от них отличаться.

Воспроизводимость

Воспроизводимость анализировалась на контрольной сыворотке и смешанной сыворотке человека с использованием анализатора Hitachi согласно руководству по модифицированному эксперименту с повторением одинаковых испытаний NCCLS. Были получены следующие результаты.

	Воспроизводимость в   рамках одного анализа			Общая   воспроизводимость
n x (мкг/мл) SD (мкг/мл) CV%	120 24,4 0,59 2,4	120 95,0 1,43 1,5	119 136,8 1,81 1,3	120 24,4 0,83 3,4	120 95,0 1,93 2,0	119 136,8 2,48 1,8

Сравнение метода

В результате сравнения метода анализа CEDIA на ВПК (y) с серийным иммунологическим анализом методом флуоресцентной поляризации (x) была получена следующая корреляция:

Линейная регрессия                                                Пассинг-Баблок

                                                           

Количество измеренных образцов: 77

Концентрации в образцах составляли от 2,6 до 119,8 мкг/мл

Линейность

Образец с высокой концентрацией разводился калибратором низкой концентрации Core TDM Multi-Cal. Затем определялся процент выхода путем деления значения, полученного в результате анализа, на ожидаемое значение.

Образец с высокой   концентрацией, %	Ожидаемое значение   (мкг/мл)	Результат анализа   (мкг/мл)	Выход, %
100 83,3 66,7 50 33,3 16,7 0,0	130,1 108,3 86,7 65,0 43,3 21,7 0	--- 112,7 87,5 67,4 43,3 20,9 ---	--- 104 101 104 100 96 ---

Выход

Вальпроевая кислота в форме образца от пациента с высокой концентрацией (с добавлением известного количества искомого вещества) добавлялась в образец от пациента с низкой концентрацией. После чего определялся процент выхода путем деления полученного в результате анализа значения на ожидаемое значение.

Образец с высокой   концентрацией, %	Ожидаемое значение   (мкг/мл)	Результат анализа   (мкг/мл)	Выход, %
100,0 83,3 66,7 50,0 33,3 16,7 0,0	141,1 117,7 94,2 70,7 47,1 23,6 0,1	--- 116,0 93,0 67,3 44,2 21,6 ---	--- 99 99 95 94 92 ---

Специфичность

Следующие соединения были проверены на перекрестную реактивность с тестом «CEDIA® Вальпроевая кислота II».

Не было обнаружено влияния на анализ CEDIA на ВПК следующих веществ:

Вещество	Концентрация
Билирубин Гемоглобин IgA IgG IgM Ревматоидные факторы Общий белок Триглицериды	60 мг/дл 1,0 г/дл 790 мг/дл 4,3 г/дл 840 мг/дл 200 МЕ/мл 10 г/дл 0,1 г/дл

 Чувствительность

 Минимальная концентрация, обнаруживаемая с помощью анализа CEDIA на ВПК, составляет 3,0 мкг/мл (20,8 мкмоль/л).